固定劑

　　
　　固定樣品的化學(xué)試劑。可快速穿過細(xì)胞質(zhì)膜，并將細(xì)胞中的生物大分子固相化，從而使死細(xì)胞的結(jié)構(gòu)接近原生活狀態(tài)。常用的固定劑有乙醇、冰醋酸、甲醛、戊二醛等。
　　固定劑最先應(yīng)用在光學(xué)顯微技術(shù)中，但光學(xué)顯微鏡中使用的沉淀凝集蛋白性的固定劑對電鏡并不特別適用。于是人們引入四氧化鋨和中性甲醛進(jìn)行固定。早期的電鏡生物樣品化學(xué)固定法都采用四氧化鋨單一固定，但四氧化鋨不能很好地保存糖原和其它碳水化合物，而且四氧化鋨在組織中的滲透速度比較慢（約2mm/h）。
　　使用注意
　　電鏡中使用的固定劑都有毒性，操作時都要很小心，盡可能在通風(fēng)櫥中完成操作。如果實驗室中發(fā)生固定劑泄漏，必須立即用大量奶粉覆蓋泄漏出來的溶液，待反應(yīng)充分后收集處理。
　　種類
　　四氧化鋨（Osmium tetroxide）
　　四氧化鋨是一種很強的氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶，分子量254，飽和水溶液的濃度為7.24%，它的水溶液為中性，有極大毒性。市售有密封的四氧化鋨晶體和四氧化鋨水溶液兩種。四氧化鋨晶體溶于水的速度很慢，必要時可以使用超聲波設(shè)備來加速溶解。市面上也有已經(jīng)配制好的2%四氧化鋨水溶液出售，使用相當(dāng)方便。但要特別注意的是無論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會揮發(fā)出四氧化鋨氣體，因此應(yīng)將四氧化鋨置于密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對呼吸系統(tǒng)有刺激，對眼睛有嚴(yán)重的破壞作用，因此在使用時應(yīng)特別小心，盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且嚴(yán)格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應(yīng)加入酒精水溶液或硫酸亞鐵溶液，使四氧化鋨轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低毒性方便收集處理。 四氧化鋨作為固定劑有如下優(yōu)點：
　　1.四氧化鋨可以與脂類、糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對脂類的固定作用可以補充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點。
　　2.能增加膜的反差，起到"電子染色"作用。用四氧化鋨固定的材料，往往細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。這是由于被還原的鋨沉積在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，而鋨是一種原子序數(shù)較高的元素，能加強它們的電子散射（質(zhì)量密度大），所以四氧化鋨作為固定劑的同時，又可作為電子染料，使被固定的樣品圖像有較好的反差。
　　3.四氧化鋨會破壞大部分細(xì)胞膜的半透膜特性，配制四氧化鋨固定液不用考慮滲透壓。
　　四氧化鋨雖然具有以上優(yōu)點，但它也存在不少缺點：
　　四氧化鋨滲透力弱，所以組織塊要小。否則，將從組織塊表面到中間形成一個固定梯度，致使內(nèi)部自溶過程繼續(xù)進(jìn)行引起組織塊內(nèi)部固定不好。
　　不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且對微管固定效果也不理想。
　　
　　固定的時間不宜太長。時間過長，會使組織變脆，給切片帶來困難。此外四氧化鋨與蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸交聯(lián)形成的復(fù)合體都是易溶于水的物質(zhì)，特別是在長時間的固定后，更易溶解。因此，使用四氧化鋨固定樣品，時間控制在12小時較為適宜。
　　四氧化鋨能與乙醇或醛類起氧化－還原反應(yīng)，生成沉淀。所以，醛類處理過的樣品轉(zhuǎn)入四氧化鋨固定之前或四氧化鋨固定之后轉(zhuǎn)入乙醇溶液脫水之前都必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗干凈。
　　四氧化鋨是酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)的研究。
　　甲醛（formaldehyde）
　　甲醛分子中只有一個碳原子，含有一個醛基，分子式為$CH_2O$，分子量為30。市面上雖然有多種形式的甲醛溶液出售，但它們含有少量的甲酸和甲醇，對被固定的樣品產(chǎn)生不良影響，適合電鏡固定使用的只有通過由多聚甲醛新鮮制備的甲醛溶液。甲醛溶液的毒性很大，即使是稀釋液也要格外小心操作。甲醛溶液對皮膚有硬化作用，長時間接觸可能導(dǎo)致皮膚破裂、皮炎或是過敏癥狀；甲醛極易揮發(fā)，它對呼吸道也有影響，長時間暴露在甲醛氣體中會使嗅覺敏感度降低；此外甲醛對眼睛也有影響，而且還被認(rèn)為是致癌物質(zhì)。因此在操作甲醛粉末或溶液時都必須很小心，帶上手套并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。少量廢棄的醛類試劑（甲醛、戊二醛和丙稀醛等）可以直接在大量流水沖稀的情況下倒進(jìn)水池內(nèi)（但要注意有關(guān)部門的有關(guān)規(guī)定），當(dāng)然少量的醛類試劑與過量的1M甘氨酸混合后，再在大量流水沖稀的情況下倒進(jìn)水池，會更安全。通常100ml的甲醛(1%)需要50ml的1M甘氨酸，100ml1%戊二醛則需要35ml，而丙稀醛需要40ml。大量的醛類試劑必須集中回收處理。
　　甲醛作為固定劑有如下特點：
　　
　　由于甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛強，反應(yīng)溫和，可用于細(xì)胞組織化學(xué)研究的前固定。而且它不象戊二醛有兩個醛基，引入較少的游離醛基到組織細(xì)胞中，因而在一些細(xì)胞組織化學(xué)研究中更有利。但它的反應(yīng)是部分可逆的，對細(xì)胞基質(zhì)保存差，脫水后大部分基質(zhì)丟失，所以不少實驗室不單獨使用甲醛來固定樣品，而將它與戊二醛配制成混合固定液使用。
　　甲醛對生物樣品的作用與戊二醛相似，主要引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。在水溶液中，單個的甲醛分子以HO ? CH2 ? OH的形式存在。
　　與戊二醛不同，甲醛既與DNA又與核蛋白反應(yīng)，但這些反應(yīng)都是部分可逆的。另外，甲醛固定脂類的能力不強，可以與脂類相連的蛋白質(zhì)作用。
　　戊二醛（glutaraldehyde）
　　
　　戊二醛是一種五碳醛，含有兩個醛基。分子式為$C_5H_8O_2$，分子量為100。電鏡固定通常用市售的25%的戊二醛水溶液稀釋成需要的濃度。其pH為4.0$\sim$5.0。氧氣、高溫、中性或堿性pH均能使戊二醛發(fā)生聚合失去醛基，并降低交聯(lián)效力，所以平時這種原液應(yīng)保存在低溫處。此外戊二醛存放時間過長時，pH值會降低，顏色變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其它雜質(zhì)時，必須純化后才能使用。戊二醛對皮膚有硬化作用，但它的揮發(fā)性較甲醛弱，最好能在通風(fēng)櫥中操作。
　　戊二醛作為固定劑有如下特點：
　　它的反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑。但它的滲透速度較慢，必要時配合甲醛使用效果更佳。
　　它是蛋白質(zhì)的強固定劑。它能快速而不可逆地與氨基反應(yīng)，和甲醛相似，戊二醛的一個醛基與氨基反應(yīng)，脫水后生成不穩(wěn)定的Schiff鍵化合物。
　　由于戊二醛有兩個醛基，它可以通過與相鄰的另一氨基反應(yīng)，而產(chǎn)生交聯(lián)作用。戊二醛的兩個醛基也可能與同一氨基作用，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)
　　這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步與另一戊二醛反應(yīng)，生成丁間醇醛冷凝物(Aldol condensate)。這種化合物與氧分子共同作用，生成穩(wěn)定的嘧啶類衍生物(Pyridine derivatives)，并在此過程中發(fā)生交聯(lián)。
　　與甲醛不同，戊二醛的這一步反應(yīng)是不可逆的，而且需要氧氣的參與。由于大塊的樣品內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足，戊二醛在大塊樣品的內(nèi)部無法形成穩(wěn)定的生成物，會導(dǎo)致樣品內(nèi)部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時，小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過交聯(lián)作用固定蛋白質(zhì)的過程會伴隨氫離子的釋放，使樣品pH值降低。為了維持pH值穩(wěn)定在最佳水平，在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩沖液。
　　戊二醛能通過固定核蛋白來固定組織和細(xì)胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白質(zhì)有關(guān)聯(lián)的或含有氨基和亞氨基的脂類。但是只使用戊二醛固定的樣品無法阻止后面的脫水、滲透和包埋過程對樣品脂類的抽提，因而對細(xì)胞膜的固定效果不理想。
　　
　　戊二醛在固定過程中并不完全破壞細(xì)胞膜的半透膜特性，因而需要選擇合適的固定液滲透壓，以免造成固定假象。但合適的固定液滲透壓隨被固定細(xì)胞和緩沖液的種類改變，很難找到一個通用的滲透壓。在實際操作中，$1.0\%-2.5\%$戊二醛（使用0.1M磷酸鹽緩沖液或0.1M二甲胂酸鹽緩沖液）在一般情況下，已經(jīng)能提供理想的固定效果。除非觀察到明顯的滲透壓造成的假象，一般不對固定液專門進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)。
　　用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進(jìn)行長時間固定（但最好不要超過一個星期），因而適用于遠(yuǎn)離實驗室或野外現(xiàn)場取材。但戊二醛在稀釋溶液中會自行發(fā)生一系列反應(yīng)，因而固定液應(yīng)盡可能新鮮配制中。
　　其它固定劑
　　醋酸鈾（uranyl acetate）}既是一種固定劑又是一種染色劑。它可以與磷酸基團反應(yīng)，從而固定DNA和RNA，以及含有磷酸基團的磷脂，從而對膜結(jié)構(gòu)的保存有幫助。另外，它可以與蛋白中的酸性基團（如天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基）和堿性基團（如賴氨酸殘基）反應(yīng)，從而起固定蛋白的作用。但醋酸鈾不能很好得保存糖原。通常在使用了醛類固定劑和四氧化鋨固定劑后，再使用$0.5-1.0\%$的醋酸鈾水溶液，進(jìn)行第三重固定。操作醋酸鈾時要特別注意，盡管市售的醋酸鈾放射性不強，但它仍是一種潛在的致癌物。醋酸鈾應(yīng)密封于棕色瓶陰涼處保存。
　　丙烯醛（acrolein）是一種三碳醛，含有一個醛基和一個雙鍵。它比甲醛和戊二醛活潑，滲透組織的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和磷脂，最好作為甲醛或戊二醛固定液的添加劑使用。通常使用市售密封的100%丙烯醛液體，固定時使用的濃度小于1%。它溶于水的速度慢，毒性很大，著火點低，儲存和使用它都比上述另外兩種醛類危險，非必要時不推薦使用。丙烯醛非常活潑且揮發(fā)性很強，即使是操作稀釋后的溶液也要格外小心，所有與丙烯醛相關(guān)的操作絕不能離開通風(fēng)櫥進(jìn)行，并且最好有經(jīng)驗豐富的操作者在場指導(dǎo)。丙烯醛適合于固定大塊的樣品，植物組織或有厚細(xì)胞壁的微生物樣品，以及表面覆蓋有幾丁質(zhì)或蠟質(zhì)的樣品。但丙烯醛不適用于整個動物的灌注固定。
　　丹寧酸（Tannic acid）是一種從植物中提取的物質(zhì)，泛指五倍子酸（gallic acid）糖苷或多聚糖苷。大分子很難滲透到組織中，因此電鏡中使用低分子量的丹寧酸。丹寧酸既是一種強的固定劑，能固定許多蛋白以及糖類衍生物，又是一種媒染劑，能增強對重金屬（如鈾、鉛）的吸收，從而增強樣品反差，特別是細(xì)胞外膜、彈性纖維、細(xì)胞連接、肌肉纖維等。由于丹寧酸滲透速度慢，通常只用作滲透速度快的固定劑的添加劑使用。丹寧酸沒有固定的用法，0.5-2.0%丹寧酸和0.5mg/ml皂角苷（saponin，增加丹寧酸的滲透速度）與2.5-4.0\%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定時間要延長到3-4小時以上，并且推薦使用醋酸鈾作第三重固定。丹寧酸適用于灌注固定。
　　重鉻酸鉀（potassium dichromate）在固定中有兩種作用，一是緩沖作用，二是固定作用，幫助保存脂類和糖類。在處理神經(jīng)組織樣品時，因為重鉻酸鉀能很好地保存髓磷脂，可與四氧化鋨配合使用，作為第二重固定劑。但需要注意的是，重鉻酸鉀是一種致癌物質(zhì)，應(yīng)小心操作。
　　高錳酸鉀（potassium permanganate）可以與脂類反應(yīng)，增強膜結(jié)構(gòu)的反差。可以保存DNA和糖原，但有一定的抽提作用，幾乎無法固定細(xì)胞內(nèi)的顆粒性或纖維狀結(jié)構(gòu)，可能會引入一些假象。穿透性強，適用于有厚細(xì)胞壁或蠟質(zhì)層包被的植物及昆蟲樣品。使用時可以不加緩沖液，固定時間不宜太長，,0.5-1.0%高錳酸鉀溶液固定30分鐘到2小時。
　　常用固定劑的配方
　　(一) 凝固型固定劑
　　1、酒精(ethyl，alcohol)
　　常用95%酒精及純酒精。酒精穿透力強，固定時間常在1小時以內(nèi)。高濃度酒精有使材料收縮的作用。70%的酒精可作保存液。配制低度酒精必須要用普通酒精即95%的酒精，絕不可用純酒精。酒精為還原劑，不能與鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等氧化劑配合。酒精可使核酸，蛋白質(zhì)及肝醣等發(fā)生沉淀，但能溶解脂肪及擬脂。
　　2、鉻酸(chromic acid)
　　
　　鉻酸是一種很好的保存劑，可以使蛋白質(zhì)沉淀，組織硬化，但是容易使組織收縮，同時滲透 亦比較緩慢。一般與其它藥劑混合使用，可以成為優(yōu)良的固定劑。平常與醋酸合并應(yīng)用，效果良好。特點：易潮解，為強氧化劑。缺點：滲透力弱，易使組織發(fā)生收縮。
　　3、苦味酸(picric acid)
　　苦味酸對于組織滲透緩慢，且能使組織強烈收縮。但可使蛋白質(zhì)。核酸等沉淀，并防止過度硬化，對以后增進(jìn)染色能力很大。一般很少單獨使用，常與其他藥劑混合使用。固定后需要用50%或70%酒精洗滌。特點：滲透力弱，易使組織發(fā)生收縮，易爆炸。注意事項：一般用50%或70%酒精洗滌。
　　4、醋酸(acetic acid)
　　醋酸為無色透明的液體，刺激性極強，冷則凝結(jié)成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以與水和酒精配成各種比例的溶液，所用濃度為0.2～5%，也常與其他固定劑配合使用。醋酸穿透性很強，單獨使用，有使原生質(zhì)膨脹的作用，故常與酒精，甲醛等合用，醋酸為固定染色體的優(yōu)良固定液，因此固定染色體的固定液中，幾乎都含有醋酸。特點：滲透力強，可使組織產(chǎn)生膨脹作用。
　　(二) 非凝固型固定劑
　　1、 福爾馬林(formalin)
　　濃度在2～10%的福爾馬林，為很好的硬化劑，但是滲透力薄弱，而且對材料會引起強烈收縮。所以最好與其他藥劑混合使用，效果會大大增加。注意的是，它亦是一種還原劑，故不宜與氧化劑鉻酸、鋨酸相混。特點：很好的硬化劑，強還原劑；滲透力弱。
　　2、重鉻酸鉀(potassium dichromate)
　　用作固定劑的濃度1～3%。其水溶液略具酸性，亦為一種強氧化劑。因此不能與酒精、甲醛液等事先儲藏。同時為一種強烈的硬化劑，滲透力薄弱，所以很少單獨使用。特點：強氧化劑，強硬化劑；滲透力弱。常與其它固定劑配合使用。
　　3、鋨酸(osmic acid)
　　此物品十分昂貴，其溶液呈中性反應(yīng)。是一種強烈的氧化劑，不能與酒精、甲醛液混用。鋨酸是目前植物制片中一種最好的固定劑，對細(xì)胞里細(xì)微的構(gòu)造能夠良好的固定，并為脂肪性物質(zhì)唯一固定劑。因此在線粒體及其他細(xì)胞器的研究中常常使用。經(jīng)鋨酸固定后，又能防止用酒精脫水時所產(chǎn)生的沉淀作用。但此種固定劑滲透十分薄弱，同時不易固定均勻，往往外邊過度固定，而里邊尚未固定完全。所以用作固定的材料應(yīng)該愈小愈好。
　　特點：中性；滲透力極弱。電鏡固定常用的固定劑；也是唯一能固定脂類分子的最好的化學(xué)固定劑。
　　4、戊二醛(glutaraldehyde)
　　特點：能與蛋白質(zhì)分子的氨基和肽鍵連接形成交連；是最常用的非凝固型固定劑。可以部分保持酶和蛋白質(zhì)的活性。固定能力比甲醛強。常用于電鏡制片的固定；用緩沖液配制。
　　(三) 混合型固定液
　　混合原則：a、優(yōu)缺點互補；b、膨脹與收縮相互平衡；c、強氧化劑與還原劑應(yīng)分別配置。 　　1、酒精-福爾馬林液
　　70% 酒精 100 ml
　　福爾馬林 2 -10 ml
　　固定植物一般組織，尤其用在柱頭中的萌發(fā)花粉管的固定。固定后的材料，立即用作觀察。通常固定24小時，可長久保存。
　　特點：不易收縮，常用于固定花粉管。
　　2、甲醛-醋酸-酒精液(FAA)
　　50% 或70% 酒精 9 0 ml
　　冰醋酸 5 ml
　　福爾馬林 5 ml
　　這個固定液在植物研究上，應(yīng)用最多，為植物組織最常用的固定液。固定時間，不受限制，短為24小時，長可延至數(shù)月或數(shù)年。野外工作，非常便利。并且固定的材料，不妨礙染色。可用以固定植物的一般組織，但用作細(xì)胞學(xué)上的固定，不如其他一些專用的固定劑。經(jīng)此液固定后的材料，可不必洗滌，直接用70%酒精脫水。
　　特點：過去稱“標(biāo)準(zhǔn)固定液”或“萬能固定液”；是組織形態(tài)中常用的固定液；同時可兼做保存液。
　　3、酒精-冰醋酸液
　　其中常用為卡諾液(Carnoy)
　　純酒精 15 ml
　　冰醋酸 5 ml
　　可用作植物組織及細(xì)胞的固定，通常固定2－24小時，視材料的大小而定。固定以后即用95%的酒精脫水；如用作細(xì)胞學(xué)上的涂片，固定后可直接回到70%酒精，然后進(jìn)行操作。
　　特點：具強滲透力，作用迅速；常用于染色體壓片法的固定。
　　4、鉻酸-醋酸-福爾馬林液
　　又名納瓦興液(Nawashin)。1912年首創(chuàng)。常用為冷多夫(Randoph)改良液。
分為甲乙兩部分，用前等量混合。
　　此液在植物制片上應(yīng)用甚廣，是細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)上一種優(yōu)良的固定液。此液原來的配方已很少應(yīng)用，現(xiàn)所用的都是改良液，且種類很多，如材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、Ⅱ；材料較堅硬，含水量較少，可用Ⅳ、V 配方，其中配方Ⅱ?qū)χ参锱咛�學(xué)制片特別適用。為了使用方便，常分別配成甲、乙兩種基液，用時臨時等量配合。固定時間為12-24小時，固定后用70%酒精洗滌數(shù)次。
　　特點：滲透慢，不能長期保存；主要用于顯示分裂相。
　　5、 精－醋酸－氯仿固定液（Carnoy fixative）
　　酒精 30毫升
　　氯仿 5毫升
　　冰醋酸 1毫升
　　可用作植物組織及細(xì)胞的固定，固定根尖和花藥只需30－60分鐘。不可在此液中放置太久（以不超過一天為宜）。
　　6、 福爾馬林－丙酸－酒精液(Johansen fluid)
　　福爾馬林 5毫升
　　丙酸 5毫升
　　50%酒精 90毫升
　　此液可用作固定一般植物組織。固定根尖細(xì)胞，用作染色體觀察。通常固定24小時，也可長期保存。
　　7、 鉻酸－醋酸固定液
　　三氧化鉻 1克
　　冰醋酸 1毫升
　　蒸餾水 100毫升
　　用于容易滲透的材料，如絲狀藻類、菌類、蕨類的原葉體等。固定12－24小時。此液不作保存液。
　　8、 鉻酸－醋酸－福爾馬林液（Licent fluid）
　　1%鉻酸 80毫升
　　醋酸 5毫升
　　福爾馬林 15毫升
　　固定液中包含氧化劑與還原劑，因此，此液用時需要臨時配制。通常固定12－24小時。
　　9、 氯化汞－鋨酸固定液（Bensley fixative）
　　2.5%氯化汞水溶液 4份
　　2%鋨酸 1份
　　此液一般可用以固定線粒體，固定12－24小時，水洗。
　　10、 鉻酸鉀－福爾馬林固定液(Regaud fixative)
　　3%重鉻酸鉀 80毫升
　　福爾馬林 20毫升
　　固定高等植物生長點，用以觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，效果良好。在植物細(xì)胞學(xué)中多采用為葉綠體的固定液。此液氧化性很強，應(yīng)用時，最好臨時配制。固定2－12小時。